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備注
BN12060-50T
50T
¥800.00
產品描述
保存條件
本試劑盒中RNase-Free DNase I 和 DNase Buffer 置于-20 ℃保存,其余組分常溫(10~25℃)保 存 18 個月。
產品簡介
本產品適合于從 10~200 mg 普通植物中提取總 RNA。試劑盒基于硅膠柱純化技術,提取過程中無 需使用有毒的酚氯仿抽提,整個提取過程只需 20~30 min。試劑盒采用 DNase I 膜上消化,可高效 地去除 DNA,得到的 RNA 可直接用于 RT-PCR、Northern Blot、Poly A 純化,核酸保護和體外翻 譯等實驗。
產品特點
? 操作簡便:20~30 min 內完成數個樣品的總 RNA 提??;
? 高效去除基因組 DNA:DNase I 膜上消化,高效去除 DNA;
? 安全低毒:無需酚、氯仿等有毒試劑;
? RNA 純度高:提取的 RNA 無雜質殘留,適用于對純度、完整性要求很高的下游實驗。
適用范圍
本產品適用于普通植物樣品的總 RNA 提取。
注意事項
1. 第一次使用前應在漂洗液 PRW1 中加入 4 倍體積的無水乙醇;
2. DNase I 工作液的配制:10 μL DNase I + 60 μL DNase Buffer,輕輕吹打混勻,現用現配;
3. 使用無 RNase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染,經常更換新手套。因為皮膚經常帶有細菌、汗 液及 RNase 等,可能導致 RNA 降解;
4. RNA 在裂解液 PRL 中時不會被 RNase 降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應使用不含 RNase 的塑 料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150℃烘烤 4 h,塑料器皿可在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 min,然 后用水徹底清洗、滅菌;
5. 配制溶液如 50%、70%乙醇應使用 RNase-Free ddH2O(將水加入干凈的玻璃瓶中,加 DEPC 至終濃度為 0.1%(V/V),混勻放置過夜后高壓滅菌);
使用方法
1. 樣品處理:用液氮將植物樣品研磨成細小粉末。稱取 10~200 mg 粉末至 1.5~2.0 mL 預冷的離 心管中(加裂解液前樣品不能解凍,初次使用推薦樣品量為 30~50 mg,根據結果再調整用量);
2. 立即加入 600 μL Buffer PRL 及 20 μL β-巰基乙醇(自備)至樣品中,高速渦旋 20~60 s 混勻 樣品,室溫靜置 5 min;
3. 室溫下 14,000×g 離心 5 min;
4. 將 RNase-Free gDNA Remove Column 裝在 2 mL 收集管中,把上一步的上清液轉移至柱子 中。12,000×g 離心 1 min,棄去柱子,保留濾液;
5. 取 0.5 倍體積無水乙醇加入濾液中,用移液槍吸打 3~5 次;
6. 將 RNase-Free RNA Column 裝在 2 mL 收集管中。取上一步混合液(≤750 μL)至柱子中。 12,000×g 離心 1 min;
7. 棄濾液,把柱子裝回收集管中。取剩余混合液至柱子,12,000×g 離心 1 min;
8. 棄濾液,把柱子裝回收集管中。加入 500 μL Buffer PRW,10,000×g 離心 10 s;
9. 棄濾液,把柱子裝回收集管中,加入 70 μL 配置好的 DNase I 溶液至柱子膜中央(DNase I 溶液:10 μL DNase I+60 μL DNase Buffer,輕輕吹打混勻)。室溫放置 15 min。
10. 加入 500 μL Buffer PRW,室溫靜置 1 min,13,000×g 離心 1 min;
11. 棄濾液,把柱子裝回收集管。加入 500μL Buffer PRW1(已添加指定量無水乙醇)至柱子中, 10,000×g 離心 10 s;
12. 重復步驟 11;
13. 棄濾液,把柱子裝回收集管。13,000×g 離心 2 min,開蓋置于室溫放置數分鐘,以徹底晾干吸 附材料中殘留的漂洗液;
注意:此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除,漂洗液的殘留,可能會影響后續(xù)的 RT 等實驗。
14. 將柱子轉移至 1.5 mL 離心管。加入 30~100 μL RNase Free ddH2O 至吸附膜中央。室溫靜置 3 min。12,000×g 離心 1 min(柱子最小的洗脫體積是 30 μL,若 RNA 產量超過 30 μg,推薦 進行第二次洗脫)棄去柱子,將洗脫的 RNA 置于-80 ℃保存。
常見問題與解決辦法
Q1:柱子出現堵塞?
A1:
1) 樣品用量過多。按照說明書推薦的要求適量取樣;
2) 樣品富含多糖多酚類物質。處理富含多糖多酚的組織,推薦用專用試劑盒提取;
3) 離心溫度過低。本產品使用操作均在室溫下進行。
Q2:提取的 RNA 出現降解?
A2:
1) 樣品用量過多。影響裂解液的裂解能力,造成 RNase 未被充分抑制,導致 RNA 降解,建議參考 說明書推薦取樣量,若要增加樣品起始量,則后續(xù)實驗中各溶液量均要按等比例增加。對于內源 RNase 含量較多的組織應減少樣品量,適當增加裂解液用量;
2) 樣品保存不當。反復解凍會引起 RNA 降解,盡量使用新鮮樣品或者解凍次數不超過 2 次的樣品;
3) 操作過程中引入 RNase 污染。請使用 RNase-Free 的工具、試劑和耗材;
4) 電泳過程中發(fā)生降解。使用 RNase-Free 的 Loading Buffer、瓊脂糖和電泳緩沖液等。
Q3:RNA 得率低?
A3:
1) 樣品用量過多。樣品過量會影響裂解效果,建議按照說明書要求適量取樣;
2) 樣品裂解不充分。請按照說明書的要求進行充分研磨、裂解;
3) 洗脫不充分。RNase Free H2O 需直接加到膜中央,并靜置 2 min 后再離心,必要時可進行二次 洗脫以提高產量;
4) 吸附柱有乙醇殘留。使用 Buffer PRW1 漂洗后需要開蓋晾干吸附柱中的乙醇。
Q4:提取的 RNA 中有 DNA 污染?
A4:
1) 樣品用量過多。超出試劑盒規(guī)定的樣本量影響裂解液的裂解能力可能會導致基因組的污染;
2) 次生代謝物較多。次生代謝物含量高的樣本在提取 RNA 時易出現基因組的污染;
3) 操作過程中需要進行去除基因組 DNA 的操作,若 DNA 含量較多,可延長 DNase I 消化時間或 重復消化。
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